Différence clé - Séquençage Sanger vs Pyrosequencing
Le séquençage de l'ADN est très important pour l'analyse de l'ADN, car la connaissance de l'arrangement correct des nucléotides sur une région d'ADN particulière révèle de nombreuses informations importantes à ce sujet. Il existe différentes méthodes de séquençage de l'ADN. Le séquençage Sanger et le pyroséquençage sont deux méthodes différentes de séquençage de l'ADN largement utilisées en biologie moléculaire. le différence clé entre le séquençage Sanger et le pyroséquençage est que Le séquençage Sanger utilise des didésoxynucléotides pour terminer la synthèse de l'ADN afin de lire la séquence nucléotidique, tandis que le pyroséquençage détecte la libération de pyrophosphate en incorporant les nucléotides et en synthétisant la séquence complémentaire pour lire l'ordre précis de la séquence..
Qu'est-ce que le séquençage Sanger ?
Le séquençage de Sanger est une méthode de séquençage d'ADN de première génération développée par Frederick Sanger et ses collèges en 1977. Il est également connu sous le nom de séquençage de terminaison de chaîne ou séquençage didésoxy car il est basé sur la terminaison de chaîne par des didésoxynucléotides (ddNTP). Cette méthode a été largement utilisée pendant plus de 30 ans jusqu'à ce que le séquençage de nouvelle génération (NGS) soit développé. La technique de séquençage de Sanger a permis la découverte de l'ordre correct des nucléotides ou la fixation d'un fragment d'ADN particulier. Il est basé sur l'incorporation sélective de ddNTP et l'arrêt de la synthèse d'ADN lors de la réplication in vitro de l'ADN. L'absence de groupes OH 3' pour poursuivre la formation de liaisons phosphodiester entre les nucléotides adjacents est une caractéristique unique des ddNTP. Par conséquent, une fois que le ddNTP est attaché, l'allongement de la chaîne cesse et se termine à partir de ce point. Il existe quatre ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP et ddTTP - utilisés dans le séquençage Sanger. Ces nucléotides arrêtent le processus de réplication de l'ADN lorsqu'ils sont incorporés dans le brin d'ADN en croissance et donnent des longueurs variables d'ADN court. L'électrophorèse sur gel capillaire est utilisée pour organiser ces courts brins d'ADN en fonction de leur taille sur un gel, comme illustré à la figure 01.
Figure 1: Électrophorèse capillaire sur gel d'ADN court synthétisé
Pour la réplication in vitro de l'ADN, quelques exigences doivent être fournies. Il s'agit de l'enzyme ADN polymérase, de l'ADN matrice, des amorces oligonucléotidiques et des désoxynucléotides (dNTP). Dans le séquençage Sanger, la réplication de l'ADN est effectuée dans quatre tubes à essai distincts avec quatre types de ddNTP séparément. Les désoxynucléotides ne sont pas totalement remplacés par les ddNTP respectifs. Un mélange du dNTP particulier (par exemple, dATP + ddATP) est inclus dans le tube et répliqué. Quatre produits de tube séparés sont passés sur un gel dans quatre puits séparés. Ensuite, en lisant le gel, la séquence peut être construite comme le montre la figure 02.
Figure 02: Séquençage de Sanger
Le séquençage de Sanger est une technique importante qui aide dans de nombreux domaines de la biologie moléculaire. Le projet sur le génome humain a été mené à bien avec l'aide des méthodes basées sur le séquençage de Sanger. Le séquençage Sanger est également utile dans le séquençage de l'ADN cible, la recherche sur le cancer et les maladies génétiques, l'analyse de l'expression génique, l'identification humaine, la détection d'agents pathogènes, le séquençage microbien, etc.
Le séquençage Sanger présente plusieurs inconvénients:
- La longueur de l'ADN séquencé ne peut pas dépasser 1000 paires de bases
- Un seul brin peut être séquencé à la fois.
- Le processus prend du temps et coûte cher.
Par conséquent, de nouvelles techniques de séquençage avancées ont été développées avec le temps pour surmonter ces problèmes. Cependant, le séquençage Sanger est toujours utilisé en raison de ses résultats très précis jusqu'à environ 850 fragments de longueur de paires de bases.
Qu'est-ce que le pyroséquençage ?
Le pyroséquençage est une nouvelle technique de séquençage de l'ADN basée sur le "séquençage par synthèse". Cette technique repose sur la détection de la libération de pyrophosphate lors de l'incorporation du nucléotide. Le processus est employé par quatre enzymes différentes: l'ADN polymerse, l'ATP sulfurylase, la luciférase et l'apyrase et deux substrats, l'adénosine 5' phosphosulfate (APS) et la luciférine.
Le processus commence par la liaison de l'amorce avec la matrice d'ADN simple brin et l'ADN polymérase commence l'incorporation de nucléotides qui lui sont complémentaires. Lorsque les nucléotides se rejoignent (polymérisation de l'acide nucléique), il libère des groupes pyrophosphate (deux groupes phosphate liés ensemble) et de l'énergie. Chaque addition de nucléotide libère une quantité équimolaire de pyrophosphate. Le pyrophosphate se transforme en ATP par l'ATP sulfurylase en présence du substrat APS. L'ATP généré entraîne la conversion médiée par la luciférase de la luciférine en oxyluciférine, produisant de la lumière visible en quantités proportionnelles à la quantité d'ATP. La lumière est détectée par un dispositif de détection de photons ou par un photomultiplicateur et crée un pyrogramme. L'apyrase dégrade l'ATP et les dNTP non incorporés dans le mélange réactionnel. L'ajout de dNTP se fait une fois à la fois. Etant donné que l'ajout de nucléotide est connu en fonction de l'incorporation et de la détection de lumière, la séquence de la matrice peut être déterminée. Le pyrogramme est utilisé pour générer la séquence nucléotidique de l'échantillon d'ADN, comme illustré à la figure 03.
Le pyroséquençage est très important dans l'analyse du polymorphisme d'un seul nucléotide et le séquençage de courtes portions d'ADN. La grande précision, la flexibilité, la facilité d'automatisation et le traitement parallèle sont les avantages du pyroséquençage par rapport aux techniques de séquençage Sanger.
Figure 03: Pyroséquençage
Quelle est la différence entre le séquençage Sanger et le pyroséquençage ?
Séquençage Sanger vs Pyroséquençage |
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| Le séquençage de Sanger est une méthode de séquençage d'ADN basée sur l'incorporation sélective de ddNTP par l'ADN polymérase et la terminaison de chaîne. | Le pyroséquençage est une méthode de séquençage de l'ADN basée sur la détection de la libération de pyrophosphate lors de l'incorporation de nucléotides. |
| Utilisation de ddNTP | |
| ddNTPs sont utilisés pour terminer la réplication de l'ADN | ddNTPs ne sont pas utilisés. |
| Enzymes impliquées | |
| L'ADN polymérase est utilisée. | Quatre enzymes sont utilisées: l'ADN polymérase, l'ATP sulfurylase, la luciférase et l'apyrase. |
| Substrats utilisés | |
| APS et Luciférine ne sont pas utilisés. | L'adénosine 5' phosphosulfate (APS) et la luciférine sont utilisées. |
| Température maximale | |
| C'est un processus lent. | Ceci est un processus rapide. |
Résumé - Séquençage Sanger vs Pyrosequencing
Le séquençage de Sanger et le pyroséquençage sont deux méthodes de séquençage d'ADN utilisées en biologie moléculaire. Le séquençage de Sanger construit l'ordre des nucléotides en séquence en mettant fin à l'allongement de la chaîne tandis que le pyroséquençage construit l'ordre précis des nucléotides en séquence en incorporant des nucléotides et en détectant la libération de pyrophosphates. Par conséquent, la principale différence entre le séquençage Sanger et le pyroséquençage est que le séquençage Sanger fonctionne sur le séquençage par terminaison de chaîne tandis que le pyroséquençage fonctionne sur le séquençage par synthèse.
