Différence clé - clonage de gènes vs PCR
La synthèse de nombreuses copies d'ADN à partir d'un fragment d'ADN spécifique est appelée amplification d'ADN. Il existe deux principaux processus d'amplification de l'ADN, à savoir le clonage de gènes et la PCR. le différence clé entre le clonage de gène et la PCR est que le clonage de gène produit les multiples copies d'un gène spécifique in vivo en construisant un ADN recombinant et en se développant à l'intérieur d'une bactérie hôte, tandis que la PCR produit des millions de copies d'un fragment d'ADN spécifique in vitro subissant des cycles répétés de dénaturation et synthèse.
Qu'est-ce que le clonage de gènes ?
Le clonage de gènes est une technique utilisée pour localiser et multiplier un gène spécifique à partir de l'ADN génomique extrait d'un organisme grâce à la construction d'ADN recombinant. L'ADN génomique contient des milliers de gènes différents codés pour les protéines. Lorsque l'ADN est extrait, il comprend tous les gènes possibles qu'il peut porter. La technique de clonage de gènes a permis la détection d'un gène spécifique à partir de l'ADN total. Par conséquent, le clonage de gènes est un outil important en biologie moléculaire.
La création d'une bibliothèque génomique d'un organisme est essentielle dans le clonage de gènes s'il n'y a aucun indice sur l'emplacement du gène concerné dans l'ADN. Une bibliothèque génomique est créée en suivant les étapes suivantes.
Étape 1: Extraction de l'ADN total d'un organisme qui contient le gène désiré.
Étape 2: Digestion de restriction de l'ADN extrait pour produire de petits fragments gérables. Cette étape est facilitée par les endonucléases de restriction.
Étape 3: Sélection d'un vecteur approprié et ouverture de l'ADN du vecteur en utilisant les mêmes endonucléases de restriction. Les plasmides bactériens sont couramment utilisés comme vecteurs pour transporter l'ADN étranger. Les plasmides sont de petits cercles d'ADN situés dans les bactéries.
Étape 4: Combinaison de l'ADN vecteur et de l'ADN fragmenté pour produire une molécule d'ADN recombinant. Cette étape est régie par l'ADN ligase.
Étape 5: Transfert de molécules d'ADN recombinant dans des bactéries hôtes. Cette étape est connue sous le nom de transformation et se fait à l'aide d'un choc thermique.
Etape 5: Criblage des cellules bactériennes transformées sur un milieu de culture. Une population mixte de cellules hôtes transformées et non transformées est obtenue à la fin du processus de transformation. En tant que gène d'intérêt, il n'est inclus que dans les cellules hôtes transformées. Par conséquent, il est nécessaire de sélectionner des cellules transformées. La sélection se fait à l'aide de milieux sélectifs qui contiennent des antibiotiques. Seules les cellules transformées poussent sur ce milieu de criblage permettant la sélection.
Étape 6: Culture de bactéries pour produire une bibliothèque de gènes. Dans cette étape, les cellules hôtes transformées sont introduites dans des milieux de culture frais qui fournissent des conditions de croissance optimales. Le nombre total de colonies sur les plaques de culture représente la bibliothèque génomique de cet organisme.
Étape 7: La molécule d'ADN recombinant contenant le gène d'intérêt doit être criblée à partir de milliers de fragments clonés d'ADN recombinant. Cela peut être accompli en utilisant des sondes qui marquent le gène spécifique ou la protéine spécifique résulte de ce gène.
Une fois que le gène intéressé contenant la colonie bactérienne est identifié parmi les colonies totales, il est possible de faire des millions de copies du plasmide recombinant qui contient le gène.
Le clonage de gènes est utilisé dans l'établissement de bibliothèques de gènes, la production de protéines spéciales, de vitamines, d'antibiotiques, d'hormones, le séquençage et la cartographie des génomes des organismes, la création de multiples copies d'ADN d'individus en médecine légale, etc.
Figure_1: Clonage de gènes
Qu'est-ce que la PCR ?
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique qui génère un grand nombre de copies d'un fragment d'ADN particulier. L'amplification exponentielle d'une séquence d'ADN spécifique est obtenue par PCR dans des conditions in vitro. Cette technique est un outil très puissant en biologie moléculaire car elle peut multiplier un petit échantillon d'ADN en une quantité utilisable. La PCR a été introduite par Kary Mullis en 1983 et cette invention primée a créé un énorme progrès en biologie moléculaire.
La technique PCR suit des réactions PCR répétées, comme illustré à la Figure 02. Une réaction PCR consiste en trois étapes principales se produisant à trois températures différentes; dénaturation de l'ADN double brin à 94 0C, hybridation des amorces à 68 0C et élongation du brin à 72 0 C. Par conséquent, lorsque la PCR est effectuée, la fluctuation de température doit être fortement maintenue pour une bonne réplication. La PCR est réalisée dans une machine PCR à l'intérieur de tubes PCR. Les tubes PCR sont chargés avec les mélanges PCR corrects contenant l'ADN matrice, la polymérase Taq, les amorces, les dNTP et le tampon. La dénaturation de l'ADN de l'échantillon double brin en ADN simple brin se fait en rompant les liaisons hydrogène entre les bases complémentaires à 94 - 98 0C. Ensuite, des brins simples d'ADN matrice sont exposés pour les amorces. Une paire d'amorces (avant et arrière) doit être fournie, et elles doivent être thermostables pour tolérer des températures élevées. Les amorces sont de courtes séquences d'ADN simple brin complémentaires aux extrémités du fragment d'ADN cible. Les amorces synthétiques sont utilisées en PCR. Les amorces se lient aux bases complémentaires de l'échantillon d'ADN et initient la synthèse d'un nouveau brin. Cette étape est catalysée par une enzyme appelée polymérase Taq; une enzyme ADN polymérase thermostable isolée de Thermus auqaticus. Lorsque des amorces et des nucléotides (blocs de construction) sont disponibles, la polymérase Taq construit le nouveau brin d'ADN complémentaire de l'ADN matrice. A la fin du programme de PCR, le fragment d'ADN amplifié est observé par électrophorèse sur gel. Si une analyse plus approfondie est nécessaire, le produit PCR est purifié à partir du gel.
PCR est très utile pour le diagnostic et le suivi des maladies génétiques et acquises, l'identification des criminels (dans le domaine de la médecine légale), l'étude de la structure et de la fonction d'un segment ciblé d'ADN, le séquençage et la cartographie des génomes d'organismes, etc. La PCR est devenue une technique de laboratoire de routine dans les laboratoires de recherche en biologie médicale et moléculaire parmi les scientifiques car elle a une grande variété d'applications.
Figure_2: Réaction en chaîne par polymérase
Quelle est la différence entre le clonage de gènes et la PCR ?
Clonage de gènes vs PCR |
|
| Le clonage de gènes est le processus qui consiste à faire plusieurs copies d'un gène spécifique in vivo grâce à l'ADN recombinant et à le transformer en une bactérie hôte. | La technique PCR produit plusieurs copies d'une séquence d'ADN particulière in vitro grâce à des cycles répétés de réactions PCR. |
| Exigence de construction d'ADN recombinant | |
| L'ADN recombinant est produit afin de localiser le gène. | L'ADN recombinant n'est pas produit. |
| Besoin de main d'oeuvre | |
| Ce processus demande beaucoup de travail. | Le travail intensif n'est pas nécessaire. |
| Procédé in vivo ou in vitro | |
| La construction de l'ADN recombinant est in vitro et l'amplification de l'ADN est in vivo. | L'amplification de l'ADN se produit complètement in vitro. |
Résumé - Clonage de gènes vs PCR
Le clonage de gènes et la PCR sont deux méthodes utilisées pour l'amplification de l'ADN. La PCR est un processus in vitro qui fait de multiples copies d'ADN d'un fragment d'ADN particulier sans utiliser d'ADN recombinant et un organisme hôte. Le clonage de gènes est principalement un processus in vivo qui aboutit à de multiples copies d'un gène intéressé à l'intérieur de l'organisme hôte via la construction d'ADN recombinant. C'est la différence entre le clonage de gènes et la PCR.
