La principale différence entre les tests PCR nichés et en temps réel conventionnels est que la PCR conventionnelle est une technique développée pour amplifier des séquences spécifiques d'ADN et que la PCR nichée est une modification de la PCR conventionnelle qui consiste en deux réactions d'amplification séquentielles, tandis que la vraie -time PCR est une variante de la PCR conventionnelle capable de quantifier le produit amplifié.
PCR est une technique scientifique très courante largement utilisée dans la recherche et la médecine pour détecter l'ADN. Les tests PCR sont utilisés pour détecter les antigènes en détectant leur ADN ou leur ARN. Généralement, l'ARN viral est présent dans le corps avant de détecter les anticorps ou d'afficher les symptômes de la maladie. Un test PCR peut dire si quelqu'un a ou non le virus dès le début. Actuellement, la PCR est le test standard pour détecter la maladie COVID-19. Il existe différents types de techniques de PCR telles que la PCR en temps réel, la PCR nichée, la PCR multiplex, la PCR à démarrage à chaud et la PCR à longue portée, etc.
Que sont les dosages PCR conventionnels ?
Le test PCR conventionnel est une technique d'amplification d'ADN in vitro couramment effectuée dans les laboratoires de biologie moléculaire. Cette méthode a permis la production de milliers à des millions de copies d'un fragment d'ADN particulier. Kary Mullis a introduit cette technique en 1980. Cette technique nécessite un fragment d'ADN connu sous le nom de matrice afin d'en faire de nombreuses copies. La Taq polymérase fonctionne comme l'enzyme ADN polymérase et catalyse la synthèse de nouveaux brins de la séquence matrice.
Les amorces du mélange PCR serviront de points de départ pour les extensions de fragments. Tous les ingrédients nécessaires pour faire des copies d'ADN sont inclus dans le mélange PCR. La réaction PCR est exécutée dans une machine PCR, et elle doit être alimentée avec le mélange PCR correct et le programme PCR correct. Si le mélange réactionnel et le programme sont corrects, il produira le nombre requis de copies d'une section particulière d'ADN à partir d'une très petite quantité d'ADN.
Figure 01: Test PCR conventionnel
Il y a trois étapes principales impliquées dans une réaction de PCR: la dénaturation, l'annelage de l'amorce et l'extension du brin. Ces trois étapes se déroulent à trois températures différentes. Le tampon PCR maintient les conditions optimales pour l'action de la Taq polymérase. Ces trois étapes de la réaction PCR sont répétées pour produire la quantité requise du produit PCR. A chaque réaction PCR, le nombre de copies d'ADN double. Par conséquent, une amplification exponentielle peut être observée dans la PCR. Le produit PCR peut être résolu par électrophorèse sur gel car il produit une quantité visible d'ADN sur un gel, et il peut être purifié pour d'autres études telles que le séquençage.
PCR est un outil précieux dans la recherche médicale et biologique. Surtout dans les études médico-légales, la PCR a une valeur immense car elle peut amplifier l'ADN pour des études à partir de minuscules échantillons de criminels et créer des profils ADN médico-légaux. La PCR est largement utilisée dans de nombreux domaines de la biologie moléculaire, notamment le génotypage, le clonage de gènes, la détection de mutations, le séquençage de l'ADN, les puces à ADN et les tests de paternité.
Que sont les Nested PCR Assays ?
La PCR nichée est un type de PCR qui réduit l'amplification non spécifique de l'ADN. Il y a deux PCR successives ou deux réactions d'amplification séquentielles dans le test PCR nichée. Lors de la première réaction d'amplification, un produit de PCR est produit. Après la première réaction, une seconde réaction d'amplification est réalisée sur le produit PCR de la première réaction. Par conséquent, les amorces du second mélange réactionnel se lient au premier produit de PCR et l'amplifient.
Figure 02: PCR imbriquée
Les paires d'amorces sont différentes dans chaque réaction. La liaison non spécifique des amorces est réduite dans la PCR nichée. Les essais de PCR nichée sont utiles pour augmenter la sensibilité et/ou la spécificité. Cependant, la PCR nichée nécessite des connaissances sur la séquence intéressée.
Que sont les dosages PCR en temps réel ?
La PCR en temps réel ou la PCR quantitative (Q PCR) est une version modifiée de la PCR qui mesure quantitativement les produits de la PCR. Par conséquent, cette technique quantifie l'amplification en temps réel à l'aide d'une machine PCR en temps réel. C'est également une méthode appropriée pour déterminer la quantité d'une séquence cible ou d'un gène présent dans un échantillon.
La caractéristique intéressante de la PCR en temps réel est qu'elle combine à la fois l'amplification et la véritable quantification en une seule étape. Par conséquent, le besoin d'électrophorèse sur gel pour la détection peut être éliminé par la technique de PCR en temps réel. L'utilisation de colorants fluorescents pour étiqueter les produits PCR au cours des réactions PCR conduira éventuellement à une quantification directe. Lorsque les produits PCR sont accumulés, les signaux fluorescents sont également accumulés et ils seront mesurés par la machine en temps réel. SYBR Green et Taqman sont deux méthodes pour détecter ou surveiller le processus d'amplification de la PCR en temps réel. Les deux méthodes surveillent la progression du processus d'amplification et signalent la quantité de produit en temps réel.
Figure 03: PCR en temps réel
La PCR en temps réel a une grande variété d'applications telles que la quantification de l'expression génique, l'analyse des microARN et des ARN non codants, le génotypage SNP, la détection des variantes du nombre de copies, la détection des mutations rares, la détection des organismes génétiquement modifiés, et détection d'agents infectieux.
Quelles sont les similitudes entre les tests PCR nichés conventionnels et en temps réel ?
- Les tests PCR nichés et en temps réel sont des modifications du test PCR conventionnel.
- Les trois techniques amplifient les échantillons d'ADN.
- Leurs produits peuvent être utilisés dans le séquençage ou l'analyse.
- Ces tests nécessitent des amorces.
Quelle est la différence entre les dosages PCR classiques nichés et en temps réel ?
La PCR conventionnelle est une technique développée pour amplifier des séquences spécifiques d'ADN. Pendant ce temps, la PCR nichée est une modification de la PCR conventionnelle qui consiste en deux réactions d'amplification séquentielles, et la PCR en temps réel est une variante de la PCR conventionnelle capable de quantifier le produit amplifié. C'est donc la principale différence entre les tests PCR nichés conventionnels et en temps réel. Contrairement à la PCR conventionnelle et en temps réel, la PCR nichée utilise deux jeux d'amorces. De plus, il existe deux réactions d'amplification successives en PCR nichée afin de réduire l'amplification non spécifique. de plus, les tests PCR conventionnels et en temps réel ne contiennent pas deux réactions d'amplification séquentielles.
L'infographie suivante répertorie les différences entre les tests de PCR imbriqués conventionnels et en temps réel sous forme de tableau pour une comparaison côte à côte.
Résumé - Tests PCR conventionnels vs imbriqués vs en temps réel
La PCR conventionnelle est la première technique développée pour amplifier des fragments spécifiques d'ADN. La PCR nichée et la PCR en temps réel sont deux variantes de la PCR conventionnelle. Il existe deux réactions d'amplification séquentielles et l'utilisation de deux ensembles d'amorces dans la PCR nichée. La PCR en temps réel est développée pour quantifier le produit PCR amplifié. Ainsi, cela résume la différence entre les tests PCR nichés et en temps réel conventionnels.
